Amplite比色法NADP/NADPH比率检测试剂盒  15274

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产品型号:15274
 牌:AAT Bioquest
公司名称:西安百萤生物科技大金线上娱乐是真的吗
  地:陕西户县
发布时间:2015-02-12
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产品简介

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产品详细信息

  

Amplite NADP/NADPH比率检测试剂盒(比色法)

货号 15274                       存储条件 f/l                     
规格                    250 Tests 价格                          4356
Ex (nm) 460 Em (nm)
分子量
溶剂
产品详细介绍

简要概述

        Amplite NADP/NADPH比率检测试剂盒 (比色法)是美国AAT Bioquest研发的检测NADP/NADPH的试剂盒,烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)是细胞中发现的两种重要的辅酶。 NAD形成NADP,通过酯键将磷酸基团添加到腺苷核苷酸的2'位置。 NADH(NADPH)是NAD(NADP)的还原形式,NAD(NADP)是NADH(NADPH)的氧化形式。 NAD或NADP在氧化还原反应中起辅助因子的作用,在细胞反应中转移电子。 氧化形式和还原形式之间的平衡是NAD / NADH(NADP / NADPH)比率。 该比率是指示细胞氧化还原状态的重要组分,并且它是反映代谢活性和细胞健康的测量。 在健康的哺乳动物组织中,游离NAD和NADH之间的比率的估计可以高达700。相反,NADP / NADPH比率通常为约0。005,因此NADPH是该辅酶的主要形式。

        该Amplite 比色NADP / NADPH比率分析试剂盒提供了一种比色法,用于测量培养细胞中细胞内总NADP / NADPH量和NADP / NADPH比率。 在该测定中,裂解物中的NADPH可以用NADPH提取溶液提取,然后通过NADPH探针识别,在反应后得到黄色染料,其在460nm处具有吸光度。 产生的染料量与细胞裂解物中NADP或NADPH的浓度成正比,可用作细胞NADP / NADPH浓度的指示剂。百萤生物是AAT Bioquest的中国代理商,为您提供**的NADP/NADPH检测试剂盒。 


产品说明书

96孔板检测示例

概述

准备25μLNADPH标准品和/或测试样品

加入25μLNADPH提取液

在室温下孵育15分钟

加入25μL中和溶液

加入75μLNADPP/ NADPH反应混合物在室温下孵育15分钟至2小时监测 在460nm处的吸光度

注意:在开始实验之前,在室温下解冻每个试剂盒组分中的一个。


操作步骤

1.准备NADPH原液:

将200μLPBS缓冲液加入到NADPH标准品(组分C)的小瓶中,得到1mM(1nmol / L)NADPH储备溶液。

注意:未使用的NADPH原液应分成单次使用的等分试样并储存在-20℃。


2.制备NADP / NADPH反应混合物:

2.1将8mL NADPH探针缓冲液(组分B-II)加入到NADP / NADPH回收酶混合物(组分A)的瓶中,并充分混合。

2。2将2 mL NADPH探针(组分B-I)加入上述瓶中(来自步骤2。1)并充分混合。

注意:这种NADP / NADPH反应混合物足以进行125~200次分析。 未使用的NADP / NADPH反应混合物应分成一次性等分试样并储存在-20℃。


3.准备连续稀释的NADPH标准品(0至2μM):

3。1将2L 1mM NADPH储备溶液(来自步骤1)加入998L PBS缓冲液(pH7。4)中,产生2M(2 pmols / L)NADPH标准溶液。

注意:稀释的NADPH标准溶液不稳定,应在4小时内使用。

3。2取200μL2MNADPH标准溶液(来自步骤3。1)进行1:2连续稀释,得到1,0。5,0。25,0。125,0。0625,0。0313和0M系列稀释的NADPH标准品。


4.运行总NADP / NADPH分析(总共400个分析/试剂盒):

4.1如说明书中的表1和2中所述,将NADPH标准品和含有NADP / NADPH的测试样品的系列稀释液加入白色/透明底96孔微孔板中。

注意:根据需要准备细胞或组织样本。 为方便起见,裂解缓冲液(组分G)可用于裂解细胞。 (详见附录)。

4.2将50μL的NADP / NADPH反应混合物(来自步骤2.2)加入NADPH标准品,空白对照和测试样品(来自步骤4.1)的每个孔中,以使总NADP / NADPH测定体积为100μL/孔。

4.3在室温下孵育反应15分钟至2小时,避光。

4.4使用吸光度读板仪在460 nm处检测吸光度的增加。


5.运行NADP / NADPH比率分析(总共250个分析/试剂盒):

5.1如说明书中的表3和4中所述,将连续稀释的NADPH标准品和/或含NADP / NADPH的测试样品加入白色/透明96孔微量培养板中。

注意:根据需要准备细胞或组织样本。 为方便起见,裂解缓冲液(组分G)可用于裂解细胞。

5.2对于NADPH提取(NADPH量):将25μLNADPH提取溶液(组分D)加入含有NADP / NADPH的测试样品的孔中。在室温下孵育10至15分钟,然后加入25μL中和溶液(组分E)以中和NADPH提取物,如说明书中的表3和4中所述。

对于总NADP和NADPH(总量):将25μLNADPP/ NADPH对照溶液(组分F)加入NADPH标准品的孔和含有NADP / NADPH的测试样品中。在室温下孵育10至15分钟,然后如说明书中的表3和4中所述添加25μL提取对照溶液(组分F)。

注意:根据需要准备细胞或组织样本。为方便起见,裂解缓冲液(组分G)可用于裂解细胞(详见附录)。


5.3将75μL的NADP / NADPH反应混合物(来自步骤2.2)加入NADPH标准品,空白对照和测试样品(NADP / NADPH)的每个孔中,并测试样品(NADPH提取物)(来自步骤5.1)以使总量达到测定体积为150μL/孔。

5。4在室温下孵育反应15分钟至2小时,避光。

5。5使用吸光度读板仪在460 nm处检测吸光度的增加。

 

数据分析

        空白孔中的吸光度(仅PBS缓冲液)用作对照,并从具有NADPH反应的那些孔的值中减去。

图1. Amplite™比色NADP / NADPH比率分析试剂盒用于使用SpectraMax酶标仪(Molecular devices)测量白色/透明96孔微量培养板中的总NADP / NADPH量和NADP / NADPH比率。

A-总NADPH和NADP剂量反应:孵育1小时可检测到低至0.03μM的总NADPH。

B-NADP / NADPH比例:用或不用NADP提取溶液处理等量的NADP和NADPH混合物15分钟,然后在室温下用提取溶液中和。 在460nm读取信号。 NADP / NADPH摩尔比基于图1B中所示的吸光度计算。


附录:使用组分G(NAD / NADH裂解缓冲液)的测试样品制剂

1.植物细胞样品:

用裂解缓冲液以200mg / mL均化,并以2500rpm离心5-10分钟,使用上清液进行测试。


2.细菌样品:

离心收集细菌细胞((10,000 g,0°C,15 min)。使用约1亿至1千万细胞/ mL裂解缓冲液,将处理后的溶液在室温下保持15分钟。以2500 rpm离心5分钟, 用上清液进行试验。


3.哺乳动物细胞样本:

从平板孔中取出培养基,每1-5百万个细胞使用约100μL裂解缓冲液(或在96孔细胞培养板中使用50-100μL/孔),并将处理过的溶液在室温下保持15分钟。 直接使用细胞裂解液或以1500 rpm离心5分钟,使用上清液进行测试。


4.组织样品:

称取约20mg组织,用冷PBS洗涤。 在微量离心管中用400μl裂解缓冲液均化。 以2500rpm离心5-10分钟,使用上清液进行测定。

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